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蛋白質(zhì)組學(xué)研究,樣本準(zhǔn)備知多少?

文章出處:轉(zhuǎn)載 作者:Lawson(洛尚中國) 人氣: 2218 發(fā)表時(shí)間:2018/3/15 17:01:13

俗話說好的開始是成功的一半,要想實(shí)驗(yàn)成功,除了要有好的idea,樣本采集和預(yù)處理也至關(guān)重要。那么蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)該如何處理樣本呢?今天咱們就來聊聊蛋白質(zhì)組學(xué)研究中那些常見樣本的準(zhǔn)備!



動物篇

  • 取新鮮組織,剔除血管、脂肪、結(jié)締組織等與研究無關(guān)的干擾組織;

  • 用生理鹽水或PBS清洗血漬和污染物,用無塵吸水紙吸去表面液體;

  • 將組織剪切成邊長 0.5 cm 小塊或 100 mg 左右小塊;

  • 將組織塊用液氮速凍5 min以上,并于-80℃保存。


腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚等常規(guī)動物組織,定量蛋白質(zhì)組推薦送樣量>200 mg;修飾蛋白質(zhì)組推薦送樣量>500 mg。



植物篇

  • 地上部分在樣本離體前用無菌水清洗雜質(zhì),水干后采集樣本;地下部分在樣本離體后,用預(yù)冷的PBS清洗雜質(zhì),無塵紙吸干后采集樣本;

  • 去除非目標(biāo)組織及衰老、霉變等干擾部分;

  • 樣品剪切成小塊,錫紙包裹或放入凍存管中;

  • 將組織塊液氮速凍5 min以上,并于-80℃保存。

 

幼嫩的根、葉、花、愈傷組織等常規(guī)植物組織,定量蛋白質(zhì)組推薦送樣量>1g;修飾蛋白質(zhì)組推薦送樣量>2 g。



血液篇

血漿樣本

  • 使用EDTA抗凝劑和蛋白酶抑制劑的血常規(guī)管采集血液;

  • 輕輕地上下顛倒混勻 8-10 次;

  • 立即4℃,1600 g離心 10 min;

  • 用移液器將血漿轉(zhuǎn)移到離心管中,加入蛋白酶抑制劑,混勻,瞬時(shí)離心。


血清樣本

  • 使用真空采血管收集血液;

  • 輕輕地上下顛倒混勻5-6 次;

  • 4℃,靜置15-30 min;

  • 4℃,1600 g離心10 min;

  • 用移液器將上層淡黃色血清轉(zhuǎn)移到離心管中,加入蛋白酶抑制劑,混勻,瞬時(shí)離心。

 

血漿/血清樣本,定量蛋白質(zhì)組推薦送樣量>500 ul。



細(xì)胞篇

貼壁細(xì)胞

  • 細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋度70-90%;

  • 去培養(yǎng)基,培養(yǎng)皿用10 ml PBS洗3次,培養(yǎng)皿倒扣,將液體控干;

  • 培養(yǎng)皿置于冰上,胰蛋白酶消化后,加入PBS懸浮細(xì)胞;

  • 收集到15 ml離心管中,4℃,400 g-1000 g離心5-10 min,去PBS;

  • 1 ml PBS重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管;

  • 再次用上述條件離心,盡可能將上清去除干凈;

  • 用適量PBS重懸,液氮速凍,并于-80℃保存。


懸浮/貼壁細(xì)胞,定量蛋白質(zhì)組推薦送樣量>1×107個(gè)細(xì)胞或體積>50ul細(xì)胞沉淀;

磷酸化蛋白質(zhì)組推薦送樣量>5×107個(gè)細(xì)胞或體積>200ul細(xì)胞沉淀;

乙酰化、泛素化蛋白質(zhì)組>1×108個(gè)細(xì)胞或體積>500ul細(xì)胞沉淀。

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微生物篇

  • 離心法或其他方法分離菌和培養(yǎng)基;

  • 收集菌體到15 ml離心管,用10 ml PBS洗3次;

  • 用1 ml PBS 重懸菌體,轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中離心,用槍頭吸去上清,記錄菌的濕重或體積;

  • 用適量PBS重懸,每管100 ul分裝,液氮速凍,并于-80℃保存。


微生物菌體,定量蛋白質(zhì)組推薦送樣量濕重>100mg或體積>100ul;修飾蛋白質(zhì)組推薦送樣量濕重>300mg或體積>300ul。



膠點(diǎn)膠條篇

膠點(diǎn)膠條

膠點(diǎn)/膠條或者泳道皆可,推薦考馬斯亮藍(lán)染色,要求條帶清晰,無降解。


IP / Co-IP / Pull-down樣本

蛋白洗脫液要求蛋白總量>5ug,蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,下方兩種電泳方式任選其一即可。

  • 蛋白洗脫液,跑分離膠5cm(不含濃縮膠的SDS-PAGE),切下5cm膠條,放入1.5ml離心管中。

  • 蛋白洗脫液,跑SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)的膠,切下目標(biāo)條帶即可,放入1.5ml離心管中。


考慮到動物、植物、細(xì)胞、微生物、膠點(diǎn)膠條大家關(guān)注度較高,今天小編就先為大家介紹到這里,如果你手上有更加棘手的特殊樣本,不知道如何處理,也可以給小編留言!分享完常見樣本的采集和預(yù)處理,下期將會給大家整理不同類型樣本蛋白質(zhì)提取方法,敬請關(guān)注m.mossblue.cn




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